Chromatografie / CHROMSERVIS.EU

Kolony ChromShell a rozpouštědla

Při používání HPLC kolon ChromShell^® je zapotřebí vzít v úvahu několik důležitých charakteristik, které mají organická rozpouštědla používaná v mobilní fázi. Viskozita je nejdůležitějším parametrem, protože rozpouštědla s vysokou viskozitou jsou příčinou zvýšení protitlaku v HPLC systému. Dalšími důležitými parametry jsou "UV cutoff", index polarity a cena. Rozpouštědla s vysokým parametrem "UV cutoff" zhoršují citlivost v UV/Vis detektorech a rozpouštědla s nízkou polaritou způsobují rychlejší eluci organických sloučenin a jsou hodně používána pro čištění nebo regeneraci kolon.

Acetonitril

je pravděpodobně nejlepší organické rozpouštědlo používané ve směsi s vodou jelikož poskytuje nejnižší protitlak v HPLC systémech. Současně má velmi nízký "UV cutoff" a tedy výbornou citlivost v UV/Vis detektorech. Největší nevýhodou je jeho cena, která se v poslední době výrazně zvýšila.

Metanol

je další velmi oblíbené rozpouštědlo, které má podobnou eluční sílu jako acetonitril, má relativně nízkou absorbanci v UV oblasti a je mnohem levnější než acetonitril. Hlavní nevýhodou metanolu při jeho používání s HPLC kolonami s malou velikostí částic je tvorba vyššího protitlaku, který může přesáhnout limit HPLC přístroje.

Aceton

je méně používané rozpouštědlo díky vysoké absorbanci v UV oblasti. Někdy se využívá při analýzách sloučenin absorbujících při vyšších vlnových délkách nebo ve spojení s jinými typy detektorů, např. MS.

Etanol

není běžně doporučován pro používání s HPLC. Ve směsi s vodou způsobuje vysoký protitlak.

Iso-, n-propanol

mají relativně silnou eluční sílu a jsou většinou používána pro čištění kolon při nízkých průtocích, protože také generují vysoký protitlak.

Tetrahydrofuran

má podobnou eluční sílu jako n-propanol, ale díky vyšší ceně je používán méně často.

Deaktivace skla

Deaktivace skla pomocí DMDCS

Dimetyldichlorsilan (DMDCS) reaguje s aktivními hydroxylovými skupinami přítomnými na povrchu skla a tím vytváří deaktivovanou plochu. Tento postup zajustí inertní skleněné nádobí určené především pro citlivé sloučeniny.

Postup

V průběhu deaktivace se vyvíjí chlorovodík (HCl). Proto je nutné provádět deaktivaci v digestoři.

K deaktivaci použijte 5% roztok DMDCS v toluenu. Roztok můžete připravit rozpuštěním 20 ml DMDCS v 400 ml toluenu. Roztok uchovávejte v tmavé skleněné nádobě při laboratorní teplotě.
Ponořte skleněné nádobé určené k deaktivaci do 5% roztoku DMDCS na dobu 15 až 30 minut.
Opláchněte sklo dvakrát toluenem.
Ponořte sklo do metanolu na dobu 15 minut.
opláchněte sklo metanolem.
Vysušte sklo čistým dusíkem (bez vlhkosti a uhlovodíků).

Nastavení lineární rychlosti

Lineární rychlost je důležitý parametr v chromatografii, který má velký vliv na separační účinnost. Proto je důležité při vývoji metod stanovení mrtvého objemu a času.

Měření lineární rychlosti v GC

Mrtvý čas se stanoví nástřikem 2 µl sloučeniny, která nemá na chromatografické koloně retenci a je detekovatelná použitým detektorem. Plynotěsnou stříkačkou odeberte plyn nebo parní fázi sloučeniny a nadávkujte ji do chromatografu. Přesně změřte čas nástřiku a čas eluce, ze kterého se stanoví mrtvý čas.

Doporučené sloučeniny pro měření mrtvého objemu v GC
Detektor	Sloučenina
FID	metan, propan, butan
ECD	chlormetan, vzduch (při nízké teplote termostatu)
TCD	metan, butan, vzduch (při nízké teplote termostatu)
NPD	acetonitril, vzduch (při nízké teplote termostatu)
MS	propan, butan, argon, vzduch (při nízké teplote termostatu)
PID	acetylen, etylen

Poznámka: Některé sloučeniny mohou mít nepatrnou retenci na kolonách se silným filmem, která je však pro podobné typy kolon reprodukovatelná.

Použití chirálních kolon

Víte jak správně používat chirální kolony na bázi celulózy/amylózy?

Chirální kolony jsou transportovány v směsi n-hexan/2-propanol (9:1, v/v). Každá kolona je individuálně testována a je vždy opatřena certifikátem kvality a separačními parametry pro stanovení trans-stilbene oxidu.

Použití mobilních fází

Kolony mohou být použity jak v normální fázi (směsi n-alkanů/alkoholů), v reverzní fázi (směsi voda/MeOH, voda/ACN a pufr/MeOH a pufr/ACN), nebo v polárních organických rozpouštědlech (100% ACN, nižší alkoholy a jejich směsi).

Kompatibilita mobilních fází

Při změnách mobilní fáze je vždy třeba dodržet stanovený postup promytí kolon. Je třeba pokaždé vyhodnotit mísitelnost jednotlivých použitých rozpouštědel. Pro bezpečné převedení kolony z hexanu do metanolu (ACN) a opačně použijte vždy jako transportní solvent 100% 2-propanol při průtoku 0,2 – 0,5 mL/min. Pro spolehlivé odstranění původní mobilní fáze propláchněte kolonu přibližně 10-ti násobkem objemu kolony (tzn. 25 ml 100% 2-propanolu pro kolonu 250 x 4,6 mm, 15 ml pro 150 x 4,6mm). Dále, pokud je použit pufr nemísitelný s 2-propanolem pak kolonu ještě propláchněte před a po použití tohoto pufru 100% vodou.

Použití modifikátorů mobilní fáze

Pro některé kyselé či bazické chirální látky je třeba použít specifických modifikátorů MF za účelem dosáhnutí správné chirální separace či požadovaného tvaru píků. Dietylamin, etanolamin nebo butylamin v koncentracích 0,1 – 0,5 % mohou být použity pro bazické vzorky, zatímco octová či trifluor octová kyselina typicky v koncentraci 0,1 – 0,2% pro vzorky kyselé. Směsi bazických a kyselých aditiv jsou rovněž možné, např. dietylamin acetát či trifluor acetát. Kolony Lux poskytují stejné výsledky při použití všech výše uvedených rozpouštědel a modifikátorů MF v uvedených koncentracích.

Nekompatibilní rozpouštědla

Chirální kolony jsou vyrobeny vázáním různých derivátů polysacharidů na povrch silikagelu. Proto veškerá rozpouštědla rozpouštějící deriváty polysacharidů nesmí přijít do styku se stacionární fází, a to i v jakékoli koncentraci, např. THF, aceton, chlorované uhlovodíky, etylacetát, dimetylsulfoxid, DMF, N-metylformamid apod.

Tlakový limit

Průtok mobilní fáze by měl být nastaven tak, aby zpětný tlak nepřekročil hodnotu 300 barů (4300 psi).

Pracovní teplota

Za použití standardních mobilních fází (jako např. n-alkany/alkoholy) je teplotní rozsah kolon 0-50°C.

Uchovávání kolon

Pro déle trvající uskladnění je doporučeno skladovat kolony ve směsi n-hexan/2-propanol (9:1, v/v). Kolony používané v reverzní MF by měli být nejprve promyty vodou (kdykoli byl použit pufr jako modifikátor reverzní MF) a poté metanolem a/nebo pouze metanolem pokud pufr nebyl použit. Kolona může být rovněž uskladněna v metanolu.

Prodloužení životnosti chirálních kolon

Chromservis doporučuje použit univerzálního systému ochrany analytických kolon a odpovídajících předkolonek k zajištění dlouhodobé a bezproblémové separace na kolonách, zvláště při separacích vzorků získaných ze složitých a komplexních matric. Optimálně by měl být vzorek kompletně rozpuštěn v odpovídající MF a poté filtrován přes stříkačkový filtr o porozitě 0.45 µm.

Rady a tipy

Laboratoř Tato stránka obsahuje technické informace, tipy a rady pro vaše rozhodování a doporučení při výběru chromatografického příslušenství.

Dynamický headspace

Metoda dynamický headspace (DHS) se využívá pro širokou řadu environmentálních aplikací. Největší její použití je při analýze těkavých organických látek (VOC) v pitné, podzemní, povrchové a odpadní vodě. Tyto matrice obsahují směs sloučenin různé polarity a těkavosti (chlorované uhlovodíky, aromatické uhlovodíky, kyslíkaté sloučeniny apod). Dynamický headspace se dále využívá pro tyto aplikace:

charakterizace koření, bylinek, potravin, mýdel a voňavek
stanovení reziduálních monomerů a VOC v polymerech
analýza zbytkových rozpouštědel v potravinářských obalech a farmaceutických produktech
ověřování "bio-potravin"
stopová analýza aktivních farmaceutických látek
analýza metabolitů v biologických kapalinách (aromatické uhlovodíky v moči, benzen v krvi)

Principle of dynamic headspace

Instalace kapilárních GC kolon

Stručný postup při instalaci kapilárních GC kolon

Poznámka: Je-li kolona nová, musíte provést její kondicionování dříve, než budete nastavovat optimální mrtvý čas.

Přepočty jednotek

Objem HPLC kapilár

ID (mm)	ID (inch)	µl/cm	µl/inch	ID (mm)	ID (inch)	µl/cm	µl/inch
0.050	0.002"	0.02	0.05	1.00	0.040"	7.85	20.59
0.064	0.0025"	0.03	0.08	1.40	0.055"	15.39	38.93
0.075	0.003"	0.04	0.12	1.52	0.060"	18.15	46.33
0.10	0.004"	0.08	0.21	1.59	0.062"	19.86	49.47
0.13	0.005"	0.13	0.32	1.65	0.065"	21.38	54.38
0.17	0.0067"	0.23	0.58	1.70	0.067"	22.70	57.78
0.18	0.007"	0.25	0.63	1.78	0.070"	24.88	63.06
0.25	0.010"	0.49	1.29	2.00	0.079"	31.42	80.32
0.38	0.015"	1.13	2.90	2.10	0.083"	34.64	88.66
0.50	0.020"	1.96	5.15	2.16	0.085"	36.64	92.99
0.75	0.030"	4.42	11.58	2.40	0.094"	45.24	113.72

UV cutoff aditiv pro mobilní fázi

Aditivum	UV cutoff (nm)
Kyselina octová, 1%	230
Octan amonný, 10 mM	205
Uhličitan amonný, 10 mM	190
Hydrogenfosforečnan amonný, 50 mM	205
CAPS 3-(cyklohexylamino)ethansulfonová kyselina, 0,1 %	215
EDTA, 1 mM	190
Kyselina chlorovodíková, 0,1 %	190
Hydrogenfosforečnan vápenatý, 10 mM	190
Hydrogenfosforečnan vápenatý, 10 mM	190
MES 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina, pH 6,0, 10 mM	215
Octan sodný, 10 mM	205
Citrát sodný, 10 mM	225
Dodecylsulfát sodný, 10 mM	190
Formiát sodný, 10 mM	200
Natrium-hexansulfonová kyselina, 5 mM	225
TEA, (triethylamin), 1%	235
TFA (kyselina trifluoroctová), 0,1 %	190
Tetrabutylamonium dihydrogenfosfát, 5 mM	200
TRIS HCl (Tris(hydroxylmethyl)aminomethan), pH 7,0, 20 mM	202
TRIS HCl (Tris(hydroxylmethyl)aminomethan), pH 8,0, 20 mM	212

Přepočty jednotek a tabulky

On-line přepočty jednotek:

Chromatografie