Chromatografia

Kolóny ChromShell a rozpúšťadlá

Pri používaní HPLC kolón ChromShell^® znamená vziať do úvahy niekoľko dôležitých charakteristík, ktoré majú organické rozpúšťadlá používané v mobilnej fáze. Viskozita je najdôležitejším parametrom, pretože rozpúšťadlá s vysokou viskozitou sú príčinou zvýšenia protitlaku v HPLC systéme. Ďalšími dôležitými parametrami sú "UV cutoff", index polarity a cena. Rozpúšťadlá s vysokým parametrom "UV cutoff" zhoršujú citlivosť v UV/VIS detektoroch a rozpúšťadlá s nízkou polaritou spôsobujú rýchlejšiu elúciu organických zlúčenín a sú často používané na čistenie alebo regeneráciu kolón.

Acetonitril

je pravdepodobne najlepšie organické rozpúšťadlo používané v zmesi s vodou, pretože poskytuje najnižší protitlak v HPLC systémoch. Súčasne má veľmi nízky "UV cutoff" a teda výbornú citlivosť v UV / Vis detektoroch. Najväčšou nevýhodou je jeho cena, ktorá sa v poslednej dobe výrazne zvýšila.

Metanol

je ďalšie veľmi obľúbené rozpúšťadlo, ktoré má podobnú elučnú silu ako acetonitril, má relatívne nízku absorbanciu v UV oblasti a je oveľa lacnejšie ako acetonitril. Hlavnou nevýhodou metanolu pri jeho používaní s HPLC kolónami s malou veľkosťou častíc je tvorba vyššieho protitlaku, ktorý môže presiahnuť limit HPLC prístroja.

Acetón

je menej používané rozpúšťadlo vďaka vysokej absorpcii v UV oblasti. Niekedy sa využíva pri analýzach zlúčenín absorbujúcich pri vyšších vlnových dĺžkach alebo v spojení s inými typmi detektorov, napr. MS.

Etanol

nie je bežne odporúčaný pre používanie s HPLC. V zmesi s vodou spôsobuje vysoký protitlak.

Izo-, N-propanol

majú relatívne silnú elučnú silu a sú väčšinou používajú na čistenie kolón pri nízkych prietokoch, pretože tiež generujú vysoký protitlak.

Tetrahydrofurán

má podobnú elučnú silu ako n-propanol, ale vďaka vyššej cene je používaný menej často.

Deaktivácia skla

Deaktivácia skla pomocou DMDCS

Dimetyldichlórsilán (DMDCS) reaguje s aktívnymi hydroxylovými skupinami prítomnými na povrchu skla a tým vytvára deaktivovanú plochu. Tento postup zaistí inertné sklenené nádoby určené predovšetkým pre citlivé zlúčeniny.

Postup

V priebehu deaktivácie sa vyvíja chlorovodík (HCl), preto je nutné uskutočniť deaktiváciu v digestore.

• K deaktivácii použite 5% roztok DMDCS v toluéne. Roztok môžete pripraviť rozpustením 20 ml DMDCS v 400 ml toluénu. Roztok uchovávajte v tmavej sklenenej nádobe pri laboratórnej teplote.
• Ponorte sklenenú nádobu určenú na deaktiváciu do 5% roztoku DMDCS na 15 až 30 minút.
• Opláchnite sklo dvakrát toluénom.
• Ponorte sklo do metanolu na 15 minút.
• Opláchnite sklo metanolom.
• Vysušte sklo čistým dusíkom (bez vlhkosti a uhľovodíkov).

Nastavenie lineárnej rýchlosti

Lineárna rýchlosť je dôležitý parameter v chromatografii, ktorý má veľký vplyv na separačnú účinnosť, preto je dôležitá pri vývoji metód stanovenia mŕtveho objemu a času.

Meranie lineárnej rýchlosti v GC

Mŕtvy čas sa stanovuje nástrekom 2 μl zlúčeniny, ktorá nemá na chromatografickej kolóne retenciu a je detekovaná použitím detektora. Plynotesnou striekačkou odoberte plyn alebo plynnú fázy zlúčeniny a nadávkujte ju do chromatografu. Zmerajte presne čas nástreku a čas elúcie, z ktorého sa stanoví mŕtvy čas.

Poznámka: Niektoré zlúčeniny môžu mať nepatrnú retenciu na kolónach so silným filmom, ktorá je však pre podobné typy kolón reprodukovateľná.

Použitie chirálnych kolón

Viete ako správne používať chirálne kolóny na báze celulózy/amylózy?

Chirálne kolóny sú transportované v zmesi n-hexán/2-propanol (9:1,v/v). Každá kolóna je individuálne testovaná a je vždy má certifikát kvality so separačnými parametrami pre stanovenie trans-stilbén oxidu.

Použitie mobilných fáz

Kolóny môžu byť použité ako v normálnej fáze (zmesi n-alkánov/alkoholov), v reverznej fáze (zmesi voda/MeOH, voda/ACN a pufer/MeOH a tlmivý/ACN), alebo v polárnych organických rozpúšťadlách (100% ACN, nižšia alkoholy a ich zmesi).

Kompatibilita mobilných fáz

Pri zmenách mobilnej fázy je vždy potrebné dodržať stanovený postup na premytie kolón. Je potrebné vždy vyhodnotiť miešateľnosť jednotlivých použitých rozpúšťadiel. Pre bezpečné prevedenie kolóny z hexánu do metanolu (ACN) a opačne použite vždy ako transportný solvent 100% 2-propanol pri prietoku 0,2 - 0,5 ml/min. Pre spoľahlivé odstránenie pôvodnej mobilnej fázy prepláchnite kolónu približne 10-tich násobkom objemu kolóny (tzn. 25 ml 100% 2-propanolu pre kolónu 250 x 4,6 mm, 15 ml pre 150 x 4,6 mm). Ďalej, ak je použitý pufor nemiešateľný s 2-propanolom, kolónu ešte prepláchnite pred a po použití tohto pufra 100% vodou.

Použitie modifikátorov mobilnej fázy

Pre niektoré kyslé či bázické chirálne látky je potrebné použiť špecifické modifikátorov MF za účelom dosiahnutia správnej chirálnej separácie či požadovaného tvaru píkov. Dietylamín, etanolamín alebo butylamín v koncentráciách 0,1 - 0,5 % môžu byť použité pre bázické vzorky, zatiaľ čo kyselina octová či trifluóroctová typicky v koncentrácii 0.1 - 0.2 % pre vzorky kyslé. Zmesi bázických a kyslých aditív sú rovnako možné, napr. dietylamínacetát či trifluóracetát. Kolóny poskytujú rovnaké výsledky pri použití všetkých vyššie uvedených rozpúšťadiel a modifikátorov MF v uvedených koncentráciách.

Nekompatibilné rozpúšťadlá

Chirálne kolóny sú vyrobené viazaním rôznych derivátov polysacharidov na povrch silikagélu. Všetky rozpúšťadlá rozpúšťajúce deriváty polysacharidov nesmú prísť do styku so stacionárnou fázou, a to aj v akejkoľvek koncentrácii, napr. THF, acetón, chlórované uhľovodíky, etylacetát, dimetylsulfoxid, DMF, N-metylformamid a pod.

Tlakový limit

Prietok mobilnej fázy by mal byť nastavený tak, aby spätný tlak neprekročil hodnotu 300 barov (4300 psi).

Pracovná teplota

Za použitia štandardných mobilných fáz (ako napr. N-alkánov / alkoholov) je teplotný rozsah kolón 0-50 ° C.

Uchovávanie kolón

Pre dlhšie trvajúce uskladnenie je odporúčané skladovať kolóny v zmesi n-hexán/2-propanol (9:1, v/v). Kolóny používané v reverznej MF by mali byť najprv premyté vodou (kedykoľvek bol použitý pufor ako modifikátor reverznej MF) a potom metanolom a/alebo len metanolom, ak pufor nebol použitý. Kolóna môže byť tiež uskladnená v metanole.

Predĺženie životnosti kolón Lux

Chromservis odporúča použitie univerzálneho systému ochrany analytických kolón Security Guard a zodpovedajúcich predkolóniek na zabezpečenie dlhodobej a bezproblémovej separácie na kolónach Lux, zvlášť pri separáciách vzoriek získaných zo zložitých a komplexných matríc. Optimálne by mala byť vzorka kompletne rozpustená v zodpovedajúcej MF a potom filtrovaná cez filter injekčnej striekačky s pórovitosťou 0.45 μm.

Rady a tipy

Táto stránka obsahuje technické informácie, tipy a rady pre vaše rozhodovanie a odporúčania pri výbere chromatografického príslušenstva.

• Dynamický headspace
• Inštalácia GC kolón
• Ako zaobchádzať s chirálnymi HPLC kolónami
• Linery pre GC
• Nastavenie optimálnej lineárnej rychlosti
• Návod na deaktiváciu sklenených nádob
• Postup pri kondicionování GC kolón
• Termálna desorpcia
• Údržba striekačiek
• Voľba GC septa
• Voľba LC kolóny
• Zlepšenie tesnosti injektorov GC Agilent
• Zlepšenie tesnosti pripojenia GC kapilárnych kolón
• Zvýšenie pomeru signál/šum v GC systémoch

Dynamický headspace

Metóda dynamický headspace (DHS) sa využíva pre širokú radu environmentálnych aplikácií. Jej najväčšie použitie je pri analýze prchavých organických látok (VOC) v pitnej, podzemnej, povrchovej a odpadovej vode. Tieto matrice obsahujú zmes zlúčenín rôznej polarity a prchavosti (chlórované uhľovodíky, aromatické uhľovodíky, kyslíkaté zlúčeniny apod.). Dynamický headspace sa ďalej využíva pro tieto aplikácie:

• charakterizácia korení, byliniek, potravín, mydiel a voňaviek
• stanovenie reziduálnych monomérov a VOC v polyméroch
• analýza zvyškových rozpúšťadiel v potravinárskych obaloch a farmaceutických produktoch
• overovanie "bio-potravín"
• stopová analýza aktívnych farmaceutických látok
• analýza metabolitov v biologických kvapalinách (aromatické uhľovodíky v moči, benzén v krvi)

Inštalácia kapilárnych GC kolón

Stručný postup pri inštalácii kapilárnych GC kolón

• Vychlaďte všetky vyhrievané zóny GC
• Skontrolujte čističe plynov a v prípade potreby ich vymeňte
• Vyčistite injektor a detektor
• Vymeňte liner v injektore/detektore za nový
• Vymeňte dôležité tesnenia v injektore a detektore
• Vymeňte septum v injektore
• Nastavte prietok detektorových plynov
• Dôkladne skontrolujte kolónu, či nie je poškodená
• Nasaďte na každom konci kolóny maticu a ferulku
• Odrežte 10 centimetrov z každého konca kolóny. Na rezanie kremenných kolón použite zafírový nôž alebo keramickú doštičku. Na rezanie kovových kolón použite keramickú doštičku alebo hranatý pilník. Nástroje na rezanie kolón nájdete v našom katalógu.
• Zaveste kapilárnu kolónu na držiaky v termostate GC, aby nedošlo k jej poškodeniu
• Vložte požadovaný koniec kolóny do injektora. Správnou dĺžku nájdete v návode na obsluhu daného GC.
• Kolónu nainštalujte tak, aby sa nedotýkala stien termostatu
• Nastavte prietok kolónou v súlade s parametrami uvedenými v testovacom chromatograme výrobcu
• Nastavte splitový pomer, oplach septa a ďalšie parametre v súlade s požiadavkami výrobcu GC
• Uistite sa, že kolónou preteká nosný plyn. Ponorte voľný koniec kolóny do vialky s rozpúšťadlom (acetón alebo izopropanol).
• Vložte požadovaný koniec kolóny do detektora. Správnu dĺžku nájdete v návode na obsluhu daného GC.
• Skontrolujte tesnosť kolóny tepelno-vodivostným detektorom. Nepoužívajte mydlovú vodu alebo kvapalné detektory netesností, pretože môže dôjsť k poškodeniu kolóny.
• Nastavte teplotu injektora a detektora. Detektor zapnite po jeho stabilizácii. Upozornenie - dbajte na to, aby ste neprekročili maximálnu povolenou teplotu kolóny!
• Teraz nastavte správny mŕtvy objem (lineárnu rýchlosť) nastreknutím metánu alebo inej zlúčeniny, ktorá nie je kolónou zadržiavaná.
• Skontrolujte tvar píku, ktorý by mal byť symetrický
• Skondicionujte kolónu pri maximálnej teplote, až sa stabilizuje základná línia detektora (v testovacom chromatogramu kolóny nájdete maximálnu použitú teplotu).
• Nastavte teplotu termostatu a znovu nastreknite metán alebo inú, zlúčeninu, ktorá nie je kolónou zadržiavaná. Upravte podmienky pre optimálnu lineárnu rýchlosť.
• Nastreknite duplicitne testovaciu zmes kolóny a zistite, v akom stave sa nachádza kolóna a celý chromatografický systém
• Nakalibrujte prístroj a teraz môžete nastrekovať vzorky

Poznámka: Ak je kolóna nová, musíte previesť jej kondicionovanie skôr, ako budete nastavovať optimálny mŕtvy čas.

Přepočty jednotek

Objem HPLC kapilár

UV cutoff aditív pre mobilnú fázu

Prepočty jednotiek a tabuľky

On-line prepočty jednotiek:

• Užitočné tabuľky v chromatografii a online prepočty jednotiek
• pK kyselín a zásad používaných ako aditívum pre mobilné fázy HPLC
• UV cutoff aditív pre mobilné fázy
• Voľba kolóny v závislosti na veľkosti nástreku a jej kapacite
• Voľba kapilár pro rôzne prietoky
• Odhad tlaku na kolónach v závislosti na veľkosti částíc, priemere a dĺžke kolóny
• Závislosť viskozity zmesi rozpúšťadiel na ich percentuálnom zložení
• Vlastnosti rozpúšťadiel
• Prepočet jednotiek veľkosti častíc
• Prevod metódy z poréznej častice na ChromShell (PRIPRAVUJEME)